Aislamiento de cromosomas del lenguado senegalés (Solea senegalensis, Kaup 1858) mediante técnicas de microdisección láser.

Abstract

El lenguado senegalés (Solea senegalensis, Kaup 1858) es un pez plano, asimétrico y ovalado que vive en el fondo marino de la costa atlántica y mediterránea del suroeste de Europa y noroeste de África. El interés en la producción de Solea senegalensis se ha incrementado, ya que es una especie muy cotizada por el mercado europeo. Este interés ha dado lugar a la puesta a punto de su producción en acuicultura, asimismo ha desencadenado en los últimos años un aumento en la investigación de las bases genéticas de la especie: identificación y secuenciación de genes, realización de mapas físicos, mapas citogenéticos, para así aplicarlo a programas de mejora. Todo esto se está desarrollando gracias a técnicas como la secuenciación de nueva generación (NGS), que permite conocer la secuencia de ADN, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ADN, la Hibridación Fluorescente in situ (FISH) para poder localizar físicamente en un cromosoma una secuencia marcada, la microdisección que es de utilidad para poder aislar cromosomas determinados y la DOP-PCR una técnica molecular que permite amplificar grandes regiones de ADN sin necesidad de conocer la secuencia y que, posteriormente, permite marcar el producto de DOP-PCR generado para la realización del pintado cromosómico mediante FISH. Por tanto, la puesta a punto de estas técnicas en el lenguado senegalés es necesaria para obtener mejores resultados en investigación. El presente trabajo se centró en la mejora de algunas técnicas, especialmente se centró en la extensión de las preparaciones cromosómicas, para continuar con la optimización de la técnica de microdisección láser y DOP-PCR a partir del material microdiseccionado. El proceso de optimización de las técnicas se basó en tres partes. En primer lugar se realizó la mejora de la técnica para la obtención de placas metafásicas variando las condiciones y protocolos de extensión. Primero se realizó en portaobjetos de vidrios convencionales y segundo en portaobjetos especiales para microdisección con una membrana de Tereftalato de polietileno (PET). Se continuó con la mejora de la técnica y condiciones para la microdisección láser del microscopio implementando una metodología de corte y ajuste de los parámetros de corte como la energía, la velocidad, el número de ciclos de corte, el enfoque del corte y el catapultado o lanzamiento de la sección cortada con un impulso láser a un tubo de PCR. Por último, se continuó con la mejora de las condiciones de la DOP-PCR. Se Utilizaron dos tipos de polimerasa, una termosensible y otra termolábil, cada una con su procedimiento. Además se ajustó la cantidad de cromosomas necesarios para una amplificación satisfactoria.

Solea senegalensis, Kaup 1858 is a flatfish, asymmetrical and oval that lives in the sea bottom of the Atlantic and Mediterranean coast of southwestern Europe and northwestern Africa. The interest in the production of Solea senegalensis has increased because it is a highly prized species by european market, the production in this region has increased in recent years. This interest has developed the aquaculture production and the growing interest has developed the research in Solea senegalensis, especially the research about genetic basis: identification and sequencing of genes, performing physical maps, cytogenetic maps, to apply to improvement programs. This has required development of techniques such as next generation sequencing (NGS) that allows knowing the DNA sequence, PCR to amplify DNA sequences, Fluorescent in situ hybridization (FISH) to physically locate on a chromosome with a labeling sequence, microdissection to isolate chromosomes and DOP-PCR, technique that allows amplify all the DNA microdissected without knowing the sequence, then the product is labeling for the realization of chromosome painting by FISH. Therefore, the development of these techniques in Solea senegalensis is necessary for better results in researching. The work focused on improving some techniques, especially It focused on the spread of metaphase spreading, to continue with the optimization of the techniques of laser microdissection and DOP-PCR from microdissected material. The optimization process was based in three steps. First, improving of technique for obtaining metaphase spreading. it developed by changing conditions and protocols spread that was performed under normal slides and second microdissection slides with a membrane of polyethylene terephthalate (PET). Then, the conditions for the laser microdissection microscope was improved. A methodology cutting was developed and the cutting parameters were adjusted such as power, speed, number of cutting cycles, the focus of the cuts and the catapult or launch of the cut section with a laser pulse to a PCR tube .Finally, the conditions of the DOP-PCR reaction were adjusted. We use two types of polymerases, a heat-sensitive and another thermolabile, each with its procedure. Also the number of chromosomes necessary for successful amplification was adjusted.