Diseño de cebadores degenerados para la amplificación del gen de la prolactina en peces perciformes

Abstract

Los perciformes conforman uno de los órdenes de peces que reportan más beneficios en la acuicultura mundial, dado su elevado nivel de producción y demanda. En España y concretamente en Andalucía, se produce atún, corvina, dorada, lubina y seriola entre otras especies de perciformes. El cultivo de estas especies se lleva a cabo generalmente en el mar o en zonas intermareales, donde el cambio de la salinidad constituye un factor a considerar en el crecimiento de los peces. El sistema endocrino juega un papel importante en la osmorregulación mediante diferentes hormonas, como la hormona del crecimiento, el cortisol o la prolactina. La caracterización y seguimiento de las hormonas que participan en la regulación de este sistema es por tanto de interés en las especies producidas, para valorar su capacidad de respuesta y actuar en consecuencia, alcanzando las condiciones óptimas de cultivo. En el presente trabajo se lleva a cabo el desarrollo de unos oligos degenerados para la identificación y amplificación de la hormona prolactina en perciformes. Un oligo (cebador o primer) es una secuencia corta de nucleótidos que hibrida gracias a su secuencia con una zona específica del ADN objetivo, de forma que es posible mediante el uso de otro oligo de sentido contrario, amplificar una zona delimitada del ADN mediante una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés). Para la realización del trabajo, se seleccionaron secuencias codificadoras de prolactina de varios perciformes del banco de datos del NCBI y se alinearon mediante la herramienta ClustalW2. Las zonas con mayor grado de conservación se utilizaron para el diseño de los cebadores, introduciendo degeneraciones en aquellas bases que presentaban diversificación. Se realizaron diferentes PCRs para comprobar su capacidad de amplificación en distintas especies de perciformes. Además, para demostrar su utilidad, se clonó y secuenció la prolactina de corvina (Argyrosomus regius), así como se diseñaron cebadores específicos para PCR cuantitativa. Mediante esta técnica se realizó la cuantificación de la expresión relativa de prolactina, en distintos individuos de corvina que estaban sometidos a diversas condiciones de salinidad 5 ‰, 12‰, 38‰ y 55‰. Los resultados obtenidos demuestran que la expresión relativa de prolactina se modifica según las condiciones ambientales a las que esté sometida el individuo, mostrándose los valores más altos de expresión en la salinidad más baja y decreciendo con el aumento de salinidad.

Perciformes are one of the greatest orders which yields more benefits to world-wide aquaculture given its high production grade and large need. Spain is one of the main producers of different perciformes species, as tuna, Mediterranean-meagre, gilt-head bream, European seabass and greater amberjack, among others. These species are mostly cultivated in the sea or intertidal areas, which may influence fish growth and development due to salinity changes. Hormones as cortisol, prolactin or growth hormone play an important role in osmoregulatory processes, so that identification and monitoring of these hormones in perciformes could support an assessment of fish state and modify subsequently cultivating conditions in order to achieve the optimal requirements of growing. The current work aims at degenerated primers designing, which makes prolactin identification and amplification in perciformes possible. A primer is a short sequence made up of nucleotides, which targets and is able to hybridize a specific DNA sequence, permitting DNA amplification through Polymerase Chain Reaction. Different perciformes DNA-coding sequences were chosen from NCBI gene bank and were aligned using ClustalW2 tool. The best conserved regions were selected for primer designing and degenerations were included where it was required. Primers amplification performance were assessed by various PCR assays in distinct perciformes species. Prolactin from Argyrosomus regius was cloned and sequenced to demonstrate primer relevance. Quantitative PCR (qPCR) primers were designed from Argyrosomus regius prolactin sequence to quantify relative expression of this hormone in different individuals acclimated to diverse salinity environment (5‰, 12‰, 38‰ y 55‰). Results display that relative expression level of prolactin is modified by salinity environmental conditions, showing the highest values of expression at 5 ‰, and gradually diminishing as salinity levels increase.