Caracterización del gen del receptor de la hormona folículo estimulante (fshr) como posible gen relacionado con la determinación del sexo en el lenguado senegalés (Solea senegalensis, Kaup 1858)

Abstract

El lenguado senegalés (Solea senegalensis) es un pez plano de creciente interés comercial perteneciente a la familia Soleidae dentro del orden de los Pleuronectiformes. Su cultivo, sin embargo, se encuentra muy limitado por importantes problemas para controlar la reproducción: la ausencia de puestas fértiles en individuos de la generación F1 impide cerrar el ciclo de reproducción en cautividad, a lo que se suma el importante grado de desconocimiento en torno al mecanismo de determinación sexual de la especie. Recientemente, se ha identificado el gen del receptor de la hormona folículo estimulante (fshr) como el locus más prometedor como marcador sexual, consistente con un sistema cromosómico XX/XY. En el presente Trabajo de fin de Grado se ha llevado a cabo una primera caracterización del gen fshr de S. senegalensis, lo que permite sentar las bases hacia la compresión del mecanismo de determinación sexual de la especie y, con el tiempo, establecer protocolos de mejora en acuicultura. Para ello, se realizó el aislamiento del gen fshr a partir de una genoteca BAC usando un método de rastreo basado en la técnica de PCR en cuatro dimensiones (4D-PCR). La secuenciación del BAC 20K13 conteniendo el gen diana se realizó mediante secuenciación de nueva generación (NGS) y, a continuación, se efectuó la caracterización bioinformática del gen, que mostró una estructura de 9,769 pb compuesta por 14 exones y 13 intrones. El análisis comparativo con otras doce especies de peces representativas demostró un alto grado de homología en la estructura del gen, así como una significativa conservación de la microsintenia del entorno genómico. Se destacó la presencia invariable del gen nrxn1a (neurexina 1a) del lado 5’ de fshr, lo que deberá constituir objeto de estudios futuros para analizar la posible relación entre la expresión de ambos genes. La localización de fshr en el complemento cromosómico de la especie se estableció mediante hibridación In Situ fluorescente (FISH), utilizando los clones BAC 20K13, 13E1 y 36E3 como sondas. Los ensayos de FISH-doble permitieron asignar el gen a la pareja 12 de cromosomas telocéntricos, así como determinar su localización cromosómica relativa, con el consiguiente aumento de la densidad del mapa citogenético de S. senegalensis. Este proyecto representa un punto de partida para estudios en mayor profundidad del gen fshr en el lenguado senegalés.

Senegalese sole (Solea senegalensis) is a flatfish of increasing comercial interest belonging to the family Soleidae within the order Pleuronectiformes. However, its cultivation is severely limited by major problems in the control of reproduction: the absence of fertile spawnings in individuals of the F1 generation hampers the completion of the reproduction cycle in captivity, in addition to the little knowledge available about the mechanism of sex determination in the species. Recently, the follicle stimulating hormone receptor gene (fshr) has been identified as the most promising locus as a sex marker, consistent with an XX/XY chromosome system. In this thesis, a first characterization of the fshr gene has been carried out, which allows us to lay the foundations for understanding the mechanism of sex determination in the species and, eventually, to stablish protocols for aquaculture improvement. To this end, the fshr gene was isolated form a BAC library using a screening method based on 4D-PCR. Sequencing of the BAC 20K13 containing the gene of interest was performed by next-generation sequencing (NGS), followed by bioinformatic characterisation of the gene, which showed a 9,769 bp structure composed of 14 exons and 13 introns. Comparative analysis with twelve other representative species showed a high degree of homology in the gene structure, as well as a significant microsinteny conservation. The unchanging presence of the nrxn1a (neurexin 1a) gene on the 5’ end of fshr was highlighted, which should be the subject of future studies to analyse the possible relationship between the expression of both genes. Location of fshr on the chromosome complement of the species was established by fluorescence In Situ hybridisation (FISH), using BAC clones 20K13, 13E1 and 36E3 as probes. Double-FISH analysis allowed the gene to be assigned to telocentric chromose pair 12, and its relative chromosomal location to be determined, thereby increasing the density of the cytogenetic map of S. senegalensis. This project represents a starting point for further in-depth studies of the fshr in Senegalese sole.