http://hdl.handle.net/10498/19564 Thu, 05 Nov 2026 20:42:03 GMT 2026-11-05T20:42:03Z http://hdl.handle.net/10498/37160 Development of fish embryonic stem cell lines as tools for basic and applied studies of interest in aquaculture Vergés Castillo, Alba Living organisms are constantly exposed to cyclical variations, whether daily, monthly or yearly, in environmental factors such as light and temperature. These external fluctuations are the result of terrestrial rotational and translational movements generated by the earth's spinning on its own axis and around the sun. Daily and seasonal variations in light duration (photocycles) affect all living organisms and give rise to a multitude of physiological and behavioural adaptations of a rhythmic nature that favour their survival. With the exception of some organisms that live in the deep ocean or in caves, these cyclical variations of light affect all living beings, making biological rhythms strongly rooted and phylogenetically conserved in most organisms from unicellular to mammals. Therefore, the study of biological rhythms and all their components (synchronising factors or input, molecular clock, rhythmic manifestations or output) is essential to understand the mechanisms of synchronisation, internal time measurement, response and anticipation to predictable environmental variations in living organisms, with circadian rhythms (with a period of around 24 h) being the ones that have aroused most interest in recent decades. As indicated above, light is one of the most studied synchronising environmental factors, determining many of the rhythmic physiological responses observed at the tissue and cellular level. However, light has effects related not only to its time-varying component (photoperiod), but also to variations in intensity and spectral quality. This is particularly important in marine aquatic environments where the water column acts as a colour filter, resulting in non-uniform light penetration as a function of depth and water characteristics (e.g., turbidity). This differential penetration of the electromagnetic wavelengths of visible light in the ocean, and its variation with depth, results in blue and green light having greater penetration of the water column in the open ocean and green light in coastal waters. In fish, as in other vertebrates, the photoperiod and the light spectrum affect important processes such as development, growth, feeding, metabolism or reproduction, both in wild and cultured animals. However, in aquaculture practice, fish are subjected to very specific environmental conditions (light, temperature, culture density, etc.), which in most cases are not optimised and do not correspond to the conditions they experience in their natural environment. This leads to physiological imbalances and deficiencies that compromise animal welfare, affect development, growth, feeding and reproduction, resulting in a deficit in production, with considerable damage to the economic profitability of the aquaculture sector. For this reason, numerous experimental studies have been carried out to gain a deeper understanding of these biological processes of productive interest and to provide a response to these dysfunctions. In this sense, laboratory studies have highlighted the experimental complexity and ethical issues associated with the use of live animals in research. Consequently, there is a need to generate new in vitro tools to complement studies previously carried out in vivo or ex vivo. These in vitro tools can be very useful for both basic and applied studies or for optimising and refining experimental protocols, thus reducing the costs and number of animals used in research, as well as the harm they suffer during sampling and subsequent sacrifice, in compliance with the 3Rs rule. Among these new in vitro tools aimed at simplifying analysis and animal experimentation, the establishment of undifferentiated embryonic stem cell lines is presented as an excellent opportunity to address studies related to growing disciplines such as Developmental Biology, Chronobiology and Environmental Physiology. As a prerequisite, these cell lines must be properly established and characterised in order to obtain reliable and reproducible results. However, for reasons of clinical interest these in vitro cellular tools have been developed mainly in mammals and in freshwater model fish such as zebrafish, with very few embryonic cell lines developed in marine fish. The main objective of this doctoral thesis is to develop of monoclonal embryonic stem cell lines of seabream, Sparus aurata, as a tool to study and characterise the different components of the circadian system (synchronising factors or input, molecular clock, overt rhythms or output) during the development of this species. To achieve this goal, we set out to identify the presence of a molecular clock in these cells, determine their daily rhythms and their synchronisation by light (photoperiod and light spectrum). We also aimed to establish the relationship of this molecular clock with the presence and expression of visual and non-visual photopigments (input) in these embryonic cells and to characterise the output of this clock by studying the daily variations and rhythms in the expression of genes associated with cell proliferation, apoptosis, DNA repair and stress in response to photoperiod and/or light spectrum. In Chapter 1, entitled "Establishment and characterisation of single cell-derived embryonic stem cell lines from the gilthead seabream, Sparus aurata", we have developed and characterised two embryonic stem cell lines derived from fertilised oocytes of seabream (Sparus aurata) at the morula stage, named SAEC-A3 and SAEC-H7. We have characterised their growth and potential in terms of embryoid body formation, differentiation and transfection capacity. In addition, we have analysed the evolution of cell proliferation under different photoperiods, revealing significant daily oscillations in the proliferative activity of these embryonic cells, which are endogenous as they are maintained under constant dark conditions. In Chapter 2, entitled "A functional light-entrainable molecular clock is revealed in gilthead seabream (Sparus aurata) from early developmental stages using an embryonic stem cell line", we examined whether SAEC-H7 cells have a molecular clock and investigated its regulation by light. Thus, in this study we have characterised the variation and daily rhythms in the expression of the main components of the molecular clock (clock, bmal1, cryptochrome1a, period1, period2 and period3) under controlled light-dark cycles and constant conditions (constant light, constant dark), as well as the response to nocturnal light pulses in this cell line. This study has allowed us to demonstrate that SAEC-H7 cells contain a molecular clock capable of synchronising with the daily light-dark cycles and that these rhythms have an endogenous character, since the oscillations of some genes of the molecular clock are maintained under constant conditions for a certain period of time. In addition, the molecular clock of SAEC-H7 cells exhibits other properties of functional clocks, such as the ability to resynchronise to inverted photocycles and the transcriptional activation of light-inducible genes such as cry1a and per2 during a nocturnal light pulse. In Chapter 3, entitled "Photoperiod and light spectrum modulate daily rhythms and expression of genes involved in cell proliferation, DNA repair, apoptosis and oxidative stress in a seabream embryonic stem cell line", we analysed the effects of white (LDW), blue (LDB), green (LDG), blue/green (LDBG) and red (LDR) light, as well as constant dark (DD) conditions on gene expression and daily rhythms of cellular markers of proliferation (pcna), DNA repair (cry5), apoptosis (bcl2, bax) and cellular and oxidative stress (hsp70, prdx2) in SAEC-H7 cells using RT-qPCR and cosinor analyses. The results obtained revealed the best performance of the cells under blue light conditions (LDB), in which all the genes analysed showed their highest expression levels and the most robust daily variations and rhythms. In blue light, the expression levels of cell proliferation (pcna), DNA repair (cry5), anti-apoptotic (bcl2) and oxidative stress (prdx2) markers peaked at the day-night transition, while pro-apoptotic (bax) and cellular stress (hsp70) markers showed their highest expression at the night-day transition, evidencing the strong synchronisation of transcription of key genes involved in the cell cycle under this light regime. The persistence of significant pcna, cry5, hsp70 and prdx2 rhythms after three days in constant darkness revealed the endogenous and circadian nature of these rhythms, and their control by the molecular clock. Finally, in Chapter 4, entitled "Light sensing in fish embryonic cells: A circadian analysis of visual and non-visual opsin expression using a seabream embryonic stem cell line", we aimed to identify the specific repertoire of visual and non-visual opsins present in the seabream embryonic stem cell line SAEC-H7 that could represent the input pathways to its circadian system and mediate light-entrained cellular responses, as well as to investigate their daily expression patterns and their endogenous nature. This study has allowed us to determine that SAEC-H7 cells express five visual opsins (sws1, sws2a, sws2b, rh2.4 and lws) and eleven non-visual opsins (opn3, opn4m1, opn4m2, opn4m3, opn5, opn6a, opn7a, tmt1a, tmt1b, tmt2a and tmt2b), ensuring sensitivity to all the wavelengths present in white light, but also beyond the visual spectrum. Most of these opsins show daily variations and/or rhythms in their expression levels, with a peak at the beginning of the day, and some of them show robust daily circadian rhythms in constant darkness, suggesting that they are under clock-control. These findings highlight the ability of embryonic fish cells to sense light and maintain synchronised rhythmic responses to light from the earliest stages of segmentation (morula). These basic studies have provided valuable information on the functioning of the circadian system in embryonic cells of seabream (Sparus aurata), which may be of great interest for understanding the effects of environmental factors such as light (and its cycles and spectrum), on processes of a markedly rhythmic nature such as cell differentiation, development, growth, metabolism, stress, feeding, reproduction, as well as on other processes of interest in the aquaculture of this species. This information may also be of great relevance for further studies on developmental biology, environmental physiology and chronobiology of other fish species of basic and aquaculture interest. Wed, 09 Apr 2025 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10498/37160 2025-04-09T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10498/33760 Innovación en metodologías analíticas para metales pesados basadas en procesos heterogéneos sólido-líquido Sánchez Ponce, Lorena A lo largo de las eras geológicas, los procesos naturales, como la actividad volcánica, la erosión de rocas y la acción de las fuerzas tectónicas, han ido liberando metales pesados en suelos y agua, dentro de un equilibrio natural. Sin embargo, algunas actividades humanas, tales como la explotación intensiva de minerales, la quema de combustibles fósiles o la producción masiva de alimentos, han alterado de manera significativa este equilibrio, llegando en ocasiones a transformar el suelo y los cuerpos de agua en depósitos de metales pesados. Este hecho es alarmante debido a la alta toxicidad, capacidad de bioacumulación y persistencia en el medio que presentan estos elementos. Actualmente existen numerosos métodos tanto para analizar como para eliminar estos metales pesados antes de que lleguen a los cuerpos de agua. El problema es que muchos de estos métodos implican un elevado coste, necesidad de personal altamente capacitado y elevados tiempos de operación, haciéndolos poco accesibles para las industrias que generan residuos acuosos cargados de metales pesados. En este contexto, la presente Tesis propone el diseño de nuevas metodologías más económicas, con menores tiempos de operación, menor gasto de reactivos y más respetuosas con el medio ambiente. Estas metodologías se basan, por un lado, en sensores ópticos para determinar metales pesados y, por otro, en técnicas de sorción para retenerlos en muestras acuosas. En los Artículos I y II, se han diseñado y optimizado sendos sensores ópticos, para el respectivo análisis selectivo de Cd(II) y Fe(II) en muestras acuosas. Este diseño contempla un estudio de la influencia en la respuesta del sensor de la composición del sensor, del valor de pH y del tipo de reguladora de la disolución acuosa; la determinación del tiempo de vida, tiempo de curado y tiempo de respuesta del sensor; así como la evaluación de la estabilidad de la respuesta a corto plazo y las características analíticas del método. Una vez diseñados y optimizados, estos innovadores sensores se han utilizado en muestras reales, evidenciando de manera concluyente su aplicabilidad. El sensor diseñado para la determinación de Cd(II) consiste en una membrana de inclusión polimérica (PIM) que incorpora la base de Schiff 2-acetilpiridina benzohidrazona (2-APBH) como molécula sensora. A través de la optimización utilizando un diseño factorial fraccionario de 3(3-1), se ha determinado que la composición ideal de la membrana del sensor es de 2,5 g de poli(cloruro de vinilo) (PVC, base polimérica), 3 mL de fosfato de tributilo (TBP, plastificante), 0,02 g de 2-APBH y 19,1 mL de tetrahidrofurano (THF, disolvente). Bajo condiciones experimentales optimizadas (pH 9,5, 60 minutos de tiempo de exposición con 2 minutos de sonicación, y 10 minutos de estabilidad a corto plazo), el sensor exhibe una respuesta lineal desde 0,07 mg/L (límite de cuantificación) hasta 1 mg/L de Cd(II), con una desviación estándar relativa de 4,04% para 0,4 mg L-1 de Cd(II). Este sensor óptico se ha aplicado con éxito a la determinación de Cd(II) en muestras de agua natural y pintura artística. El sensor para la determinación de Fe(II) se basa en la inmovilización del reactivo cromóforo saliciloilhidrazona del picolinaldehido (SHPA) en una membrana de inclusión polimérica (PIM). Para minimizar el uso de disolventes, el reactivo SHPA se sintetiza utilizando un procedimiento mecanoquímico. La optimización de los componentes del sensor, utilizando el método simplex secuencial, revela una composición óptima de 0,59 g de triacetato de celulosa (CTA, base polimérica), 0,04 g de SHPA, 4,9 mL de ftalato de dibutilo (plastificante, DBP), y 38 mL de diclorometano (DCM, disolvente). Bajo condiciones experimentales optimizadas (pH 6, 90 minutos de tiempo de exposición, y 10 minutos de estabilidad a corto plazo), el sensor muestra un rango lineal desde el límite de cuantificación (1,59 µmol/L) hasta 54 µmol/L de Fe(II), con porcentajes de precisión de 1,44% y 1,19% para 17,9 y 45 µmol/L de Fe(II), respectivamente. Además, el sensor facilita el diseño de un esquema de especiación Fe(II)/Fe(III), lo que permite la determinación de hierro en diversas muestras como conservantes alimentarios, aditivos alimentarios, suplementos dietéticos, y fertilizantes agrícolas. Por otro lado, en el Artículo III, se ha realizado un estudio sobre la capacidad de retención de metales pesados (Cd(II), Co(II), Ni(II) y Pb(II)) de diversos biosorbentes preparados a partir de biomasas procedentes de residuos agrícolas. En este contexto, se han examinado los porcentajes de biosorción y la capacidad de biosorción de biosorbentes procedentes de semilla de uva "Palomino Fino", orujo de uva "Cabernet Sauvignon", hueso de níspero, tallo de brócoli "Calabrese", vaina de algarroba vacía, vaina de haba vacía, cáscara de naranja amarga verde, naranja china (Kumquat), pulpa de naranja "Valencia late", pulpa de plátano de Canarias y cáscara de naranja "Valencia late" para cada uno de los iones metálicos estudiados. De este estudio se concluye que la vaina de haba vacía es la biomasa que más destaca debido a las altas tasas de retención obtenidas para Pb(II) (91,5%), Cd(II) (61,7%), Co(II) (40,7%) y Ni(II) (39,7%), indicando su potencial como biosorbente. Además, la semilla de uva "Palomino Fino", el tallo de brócoli, la vaina de algarroba vacía y la cáscara de naranja amarga verde, también muestran prometedoras capacidades de biosorción. A raíz de los ensayos y resultados del Artículo III, se ha seleccionado la semilla de uva "Palomino Fino" como el biosorbente para el diseño y optimización de un nuevo método de biorremediación destinado a la eliminación de Cr(VI) presente en muestras acuosas (Artículo IV). En la primera fase del estudio, se procede a caracterizar el biosorbente mediante la determinación del contenido de grasas y aceites (21%), la medida de las densidades volumétrica (0,68 ± 0,05 g/mL) y aparente (1,02 ± 0,09 g/mL), la porosidad (33,3%) y la evaluación de la capacidad de adsorción de iodo (1600 ± 10 mg/g). Además, se lleva a cabo el análisis mediante espectroscopía infrarroja (FTIR) y microscopía electrónica de barrido (SEM-EDX), donde se ponen de manifiesto las características morfológicas y los grupos funcionales del biosorbente capaces de participar en la biosorción de Cr(VI). También se determinan el punto de carga cero (pHpzc) (5,2) y la carga superficial negativa (2,4 ± 0,2 mmol/g) del biosorbente. Posteriormente, se establecen las condiciones óptimas del proceso de biosorción, considerando aspectos como la concentración del biosorbente, el pH y el tiempo de contacto. Bajo las condiciones óptimas (pH 5,5; 15 g/L de biosorbente, y 8 horas de tiempo de contacto) el porcentaje de biosorción obtenido es 91,7 ± 0,6%, mostrando un potencial prometedor para la eliminación de Cr(VI) en muestras acuosas. La capacidad de biosorción es lineal desde 0 hasta 2 mmol/L de Cr(VI), con una precisión del 0,64% para la retención de 1 mmol/L de metal. Para comprender el mecanismo involucrado en la retención de Cr(VI), se han llevado a cabo estudios cinéticos, de isotermas y termodinámicos del proceso de sorción, los cuales revelan una combinación de mecanismos de sorción física y química para la retención de cromo. Los parámetros termodinámicos indican la naturaleza espontánea y endotérmica del proceso, atribuyendo el éxito de la biosorción a los componentes de la semilla de uva, rica en compuestos antioxidantes y lignocelulósicos. Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10498/33760 2024-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10498/33397 Caracterización de la función de la proteína humana znf330/noa36 mediante estudios interactómicos y de mutagénesis con el sistema crispr/cas9 Sánchez-Briñas Otte, Alejandra Inicialmente descrita como un autoantígeno, NOA36/ZNF330 (NOA36 de aquí en adelante) es una proteína nucleolar con dominios en dedos de zinc cuya secuencia de aminoácidos está muy conservada en grupos taxonómicos eucariotas unicelulares y pluricelulares, tanto del reino animal como vegetal, lo que indica que debe tener un papel fisiológico muy relevante. El gen de NOA36 se expresa en todos los tejidos y líneas celulares humana y, aunque anteriormente se relacionó la función de esta proteína con la apoptosis en células humanas y la morfogénesis muscular y la hematopoyesis en Drosophila, hay pocos estudios que indaguen su papel fisiológico o su interacción con otras proteínas. En esta tesis se investiga la interacción de NOA36 con otras proteínas mediante un estudio interactómico en el que se combina la inmunoprecipitación con el análisis proteómico mediante espectrometría de masas (AP-EM), utilizando extractos de proteínas de células HeLa que sobreexpresan la proteína recombinante Flag-NOA36. Como resultado de este estudio se encontró que NOA36 interacciona con las proteínas de choque térmico HSPA1 y HSPA8, lo que posteriormente se validó mediante co-inmunoprecipitación de las proteínas recombinantes en células HeLa y HEK293. En este análisis se detectó también una posible interacción con la proteína Enhancer of Rudimentary Homolog (ERH) que en células humanas está involucrada en la regulación del ciclo celular. Dado que estos resultados indicaban que NOA36 podría estar relacionada con la respuesta al estrés y el ciclo celular, se realizaron ensayos de tratamiento de choque térmico en células HEK293 en las que se examinó la apoptosis, el ciclo celular y la proliferación mediante citometría de flujo. Para analizar la falta de función del gen NOA36 se empleó una línea celular derivada de HEK293 en la que se eliminó su expresión mediante la tecnología CRISPR/CAS9n (línea celular 2D12). Los resultados obtenidos indican que la falta de expresión de NOA36 no afecta a la apoptosis inducida por el choque térmico, pero sí al ciclo celular y la proliferación. Así, la población de células en fase S en 2D12 disminuyó drásticamente 24 horas después del choque térmico, mientras que en la línea parental HEK293 se produjo una disminución significativamente menor y además se observó a una disminución en G1 y un aumento de la población en fase G2. Asimismo, la sobreexpresión de Flag-NOA36 en células 2D12 restableció la proliferación. Para investigar si la falta de función de NOA36 afectaba a la producción de las proteínas de choque térmico, se realizó un análisis mediante RT-qPCR de la expresión los genes HSPA1, HSPA8 y HSP90AB en las líneas celulares HEK293 y 2D12, tanto en células tratadas con choque térmico como en células sin tratar. Este análisis reveló que no había diferencias drásticas entre ambas líneas celulares, lo que indica que el efecto observado en el ciclo celular no se debe a una diferente expresión de los genes HSP. Por último, se investigó el dominio responsable de la muerte celular descrito previamente con la sobre-expresión de NOA36-eGFP en células HeLa (aminoácidos 92-139 fusionados a eGFP) utilizando un péptido sintético y como vehículo de entrada en las células, una secuencia CPP (cell penetrating peptide) que se testó en varias líneas celulares. Aunque el análisis mediante citometría de flujo mostró que tratamientos con 5 uM del péptido en la línea celular de cáncer de ovario IGROV provocaba apoptosis, este efecto no fue específico de secuencia, ya que el tratamiento con un péptido scramble provocó un aumento similar de apoptosis. Estos resultados indicarían que estas células son sensibles al tratamiento, como parece indicar el aumento de vacuolas citoplasmáticas, posiblemente autofágicas. Fri, 31 May 2024 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10498/33397 2024-05-31T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10498/28922 Diterpenes as models for the study of their effect on neural progenitor cells and on cytochrome p-450 enzymes Ezzanad, Abdellah Therapeutic strategies designed to promote endogenous neurogenesis in the adult brain are a new way to approach the treatment of traumatic and neurodegenerative brain damage. Protein kinase C (PKC) are a group of kinases involved in many cell events, and it has recently been proposed that the modulation of their activity may lead to treatments to promote endogenous neurogenesis. Our research group have shown in previous studies that non-tumor pharmacophores like 12- deoxyphorbols (DPA) and lathyranes with ingol skeleton (ELAC) promote proliferation process in adult neural progenitor cell (NPC) via PKC-activating, thus improving the brain's endogenous neurogenic response to traumatic injury. Occurrence of these compounds on minute amounts on the known sources is a major obstacle to consider them adequate as therapeutic agents. Therefore, the development of these compounds as therapeutic agents requires the exploration of their chemistry in order to be able to guarantee the availability of sufficient quantities of the active compounds and to establish the minimum structural requirement for its activity. In this context, Euphorbia resinifera was selected based on its well-known potential as a source of secondary metabolites, mainly diterpenes. Exhaustive studies of the spectroscopic and spectrometric data were explored following two basic axes: 1- Phytochemical investigation : Phytochemical investigation on latex of Euphorbia resinifera led to the ísolation and identification of eighteen diterpene compounds, including one 12,20-dideoxyphorbol 13-ester, eight 12-deoxyphorbol 13-ester, five 12-deoxy-16-hydroxyphorbol 13,16-diesters, two ingol tetraesters and one daphnane. 2- Development of analytical methods for identification of Euphorbia component. A Ultra-High performance liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry (UHPLC/HRMS) based targeted and untargeted identification workflow using MSE data-independent acquisition tandem mass spectrometry was developed to analyze and assist isolation of secondary metabolites from a complex phytochemical source. This approach was applied for a biased untargeted screening of new diterpene esters from latex of a Euphorbia resinifera extract. The analysis of E. resinifera fractions revealed that previously not described diterpene esters, including 12,20-dideoxy-phorbol, 12-deoxyphorbol and 12-deoxy-16-hydroxy-phorbol esters, were present in the samples. Consequently, with the aim of using these skeletons as models of new pharmacological agents, 12-deoxy-16-hydroxyphorbol 12,13-diesters (DPPI, DPPT and DPPBz) and phorbol 12,13-diesters described in this work, has been investigated by testing the their ability to release TGFa and promote NPC proliferation, in vitro. The results showing in this thesis provide that those compounds that facilitate the release of TFGα, promote the proliferation of NPC. Furthermore, in order to shed light on phase I metabolism of tigliane derivative, a library of phorbol esters and 12-deoxyphorbol derivatives were tested against microsomal cytochrome P-450 enzymes (CYP450). Based on a high-throughput fluorescence assay of CYP inhibition, many of the tested compounds inhibited two classes of CYPs: CYP3A4 and CYP19. Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10498/28922 2022-01-01T00:00:00Z